1樓：生物女學霸
實驗前期準備前期準備主要是提取、反轉錄和引物設計部分。
1. RNA 提取注意事項
首先了解一下，RNA 抽提原則：保證 RNA 的一級結構、無其它物質的汙染、得率高、覆蓋所有轉錄本。再比較一下 Trizol 提取和試劑盒提取，Trizol 提取相對來說耗時長、含有害化學物質、純度低、RNA 完整度不高；而試劑盒提取的優點是效率高、純度高、完整度高，各位可根據實際科研情況選擇操作方法。
RNA 提取注意事項：
① 使用無 RNase 的塑料製品和槍頭，玻璃器皿要消毒，避免交叉汙染；使用效能較好的移液器，如 Eppendorf、Thermo 等；
② DEPC 有劇毒，小心配製；配製溶液應使用無 RNase 的水；
③ 操作人員應戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套；
④ 樣品應避免反覆凍融，否則影響提取 RNA 提取得率和質量；
⑤ 若下游實驗對 DNA 非常敏感，可用不含 RNase 的 DNase I 對 RNA 進行處理。
2. 反轉錄注意事項
秉承避免 RNA 被汙染和降解的原則，按照產品說明書進行即可，本文對反轉錄過程的引物設計和注意事項給出了較明確的提示。
3. qPCR 引物設計注意事項
qPCR 過程中需要使用基因特異性引物擴增，從而分析目的基因表達量。
① 推薦使用軟體 Primer Premier 5.0；
② qPCR 過程中使用引物長度推薦 25bp ，擴增產物長度 150bp ，可在 100bp-300bp 之間；
③ 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不宜超過2℃，Tm 值在 60℃-65℃ 之間為佳；
④ 引物鹼基分布要均勻，避免出現連續的4個相同鹼基，GC 含量控制在50%左右，3』端最後乙個鹼基最好為 G 或 C；
⑤ 引物內部或者正反兩條引物間最好避免出現有3個鹼基以上的互補序列；
⑥ 引物特異性需要用 NCBI BLAST 程式進行核對。避免引物3』端有2個鹼基以上的非特異性互補；
⑦ 引物設計完成後需進行擴增效率檢測，將擴增效率相同的引物用於定量比較分析。
4. 實驗方法的選擇
兩步法：退火與延伸相同溫度，最高可以達到72℃（很少採用），常用60℃，此溫度下擴增引物二聚體和錯配等擴增干擾較少，特異性高；每個迴圈時間較短，節約時間成本。
三步法：適合需要較高退火溫度的引物，獲得相對嚴謹的資料。
前期準備完畢，我們就可以進行接下來的實驗了，為了避免踩到坑里，請仔細閱讀！
實驗中期操作中期操作主要分為試劑的儲存、模板製備、體系配製、實驗程式設定和內參選擇幾個部分，具體內容如下：
1. 試劑儲存
-20℃ 避光長期儲存，避免反覆凍融，使用前充分混勻，但要避免產生氣泡。部分試劑解凍後可能出現絮狀物質，4℃ 放置並上下顛倒混勻至溶液澄清，不影響試劑效能。
2. 模板的製備
通常 1g RNA 的反轉錄產物需要稀釋10倍左右，以減輕 RNA 對 PCR 擴增的抑制。梯度稀釋時，Ct 值落在15-28範圍的稀釋倍數作為原始模板稀釋度，在此基礎上進行5-10倍稀釋。模板為 cDNA 原液時，上樣量不超過 qPCR 反應總體積的1/10。
3. 體系配製
① 請於超淨工作台內配製，並使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管；推薦使用帶濾芯的槍頭，避免交叉汙染和氣溶膠汙染。
② 推薦 10μL（q225、NOVO Max100）、20μL、50μL 體系；將引物和 qPCR Mix 混合配成大體系，混合均勻，為避免誤差，可多配製1-2個加樣孔的量，保證體系穩定性。
③ 通常引物終濃度為 0.2μM，也可以根據情況在 0.1-1.0μM 之間進行調整。
4. 實驗程式設定
① 預變性推薦時間5min，根據不同模板和引物的具體情況可適當縮短至2min。此外，根據不同的廠家的產品可以有對應的預變性時間。
② 退火溫度根據引物和目的基因的長度適當調整。
表1 不同螢光染料對應機型
5. 內參的選擇
6. 如何篩選內參基因？
首先可以選擇多個內參基因作為校正標準，再者可以使用 GeNorm、NormFinder 和 BestKeeper 比較內參基因表達的穩定性，使用軟體 GeNorm、基因晶元資料和 EST 資料庫篩選內參基因。
最後，只有更多的練習才能更好的克服問題，基本的操作部分以及注意事項就這麼多了，能不能做好就看你自己了。
2樓：王小
PCR擴增注意事項其實很多，而且都不能忽略，尤其是要保證擴增特異性（可以使用熱啟動PCR酶擴增），等到實驗做多了，就不言而喻了
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