1樓：Whelixy
1 做螢光定量PCR之前，考慮到的是你能接觸到什麼機型的PCR儀，不同的PCR儀相容的耗材以及試劑不一樣的，如果你沒有別人帶，自己第一次做，一定要注意。
2 做螢光定量PCR最重要的莫過於，引物和模板的準備。提取RNA之後一定要電泳檢測其降解狀態，如果發生了降解很容易導致結果偏差；引物設計的好壞直接關係著後續實驗的成功，所以引物合成回來，可以做個普通的pcr，跑電泳驗證其特異性。如果同時要檢測很多的基因，那麼設計的時候，引物的Tm最好都相近在60度左右，擴增產物150bp左右最好，有利於操作。
3 螢光定量PCR的體系確定，大的體系容錯率可能稍微高一點，小的體系對操作的精度和準度要求比較高，但是可以很好的的節省cDNA模板。如果沒有電動的分液槍，要熟練的使用普通移液器。
4 進行具體實驗之前，要測定引物的擴增效率，通常來說，比較兩種處理中基因表達的差異是需要內參基因的，這樣的比較，是假定興趣基因引物以及內參基因的擴增效率相同且為1的。如果引物太多，可以看螢光定量PCR的擴增曲線，如果形態相近的話，一般也認為擴增效率是一致的。
5 螢光定量PCR最少設定三個技術性重複組，同時一定要有空白對照組，有很多人沒有這種習慣，其實很危險。
6 螢光定量PCR的程式和普通PCR不同，會多乙個melting的部分，同時三步迴圈中延伸的部分可以去掉，節省時間。
7 螢光定量PCR結束之後要去看下溶解度曲線，每種擴增產物的曲線為單峰既Ok
8 資料的處理，這部分首先要根據sd值判斷資料質量。如果重複組資料波動很大，則會導致結果不可信，當然如果設定的重複組較多，有些明顯的單個異常值可以去掉，優化資料。最後需要根據不同的目的來對資料進行不同的計算處理。
2樓：HonYi Chang
沒直接做過這個實驗，但是我在學習的時候老師不斷地強調，螢光定量PCR的最重要也是最容易出錯的一點就是確保螢光位點已經在PCR中鏈結上去，詳細證明方法只有匯入受體後才能證明，所以要極其認真小心PCR，免得多次失敗後心態崩了。
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