1樓：韓默
拖了好幾天才把文章看完。自己不是做底層測序技術的，隨便談談好了。
首先是一些基礎知識和技術細節，不感興趣的可以跳過。
作者在正文裡也提到了，第二代測序技術裡的SBS（邊合成邊測序）又可以分成兩種子類別。文章作者按照領域內的習慣把它們稱為CRT（迴圈可逆鏈終止法）和SNA（單核苷酸追加法），不過我更喜歡用另一種分法——檢測合成以後的DNA分子，還是，檢測合成DNA時釋放的小分子化合物。
CRT可以說是隨機鏈終止法的直接發展。每輪反應同時投入四種修飾了3'羥基的dNTPs，每種鹼基對應不同的螢光標記。理想情況下，每輪反應中，模板鏈的反向互補鏈會且僅會延伸1個鹼基、且只有新合成的這1個鹼基有螢光訊號，只要用光學系統識別這個螢光訊號即可判斷這1個新和成的鹼基是什麼（例如Illumina/Solexa）。
接下來去掉螢光基團和3'羥基上的修飾（往往螢光基團就是用來修飾3'羥基的），就可以進行下一輪的合成也就是對下乙個鹼基進行測序了。通過把不可逆的雙脫氧修飾變成可逆修飾，大幅度減少了對每個模板鏈進行測序時需要合成的新鏈的條數——如果裝置的檢測能力下限是100個分子同時發出的訊號，那麼測100個鹼基序列時隨機鏈終止法理論上需要至少合成100x100條新鏈，而CRT法只需要合成99+100條，這就為提高測序通量提供了基礎。
這種方法的缺點在於，任何化學反應實際上都不可能是「完全」的，前面輪次摻入的螢光基團不可能被完全清除乾淨、可供新一輪反應使用的底物也會越來越少、拍照時的激發光也可能損傷DNA分子，所以隨著反應輪次的增加訊號會越來越弱、雜訊會越來越大，最終錯誤率高到不可容忍。
SNA相比於CRT，在反應步驟上進行了大幅度的簡化——投入的dNTPs是不修飾或摻入時自動去修飾的，因此不再需要用單獨的反應步驟去除3'羥基的修飾基團和新摻入鹼基的螢光基團。既然新摻入的dNTPs是沒有修飾的，那當然就不能再一股腦把四種全加進去了，所以每次只投入1種dNTP，如果它正好跟模板鏈上的下1個或下n個鹼基配對，那就會被摻入到新合成的DNA鏈上去，同時釋放出某些小分子（DNA的合成是典型的縮合反應，A+B=A'B'+C）。通過定量地檢測小分子C（例如羅氏的454焦磷酸測序）或者C進一步反應產生的產物（例如Life的Ion Torrent檢測H+濃度變化），就可以判斷這輪反應裡模板鏈的反向互補鏈到底被延伸了幾個鹼基，也就讀出了這一段序列。
通過簡化反應步驟，SNA可以達到比CRT更長的測序讀長，還可以節省試劑成本、縮短測序時間。
而這種方法的缺點則在於，現有技術對小分子的定量檢測的準確性/解析度不夠，所以如果模板鏈上有多個連續的相同鹼基（在生物中很常見）時可能會出現定量錯誤，導致測得的連續相同鹼基個數出現錯誤。
個人認為，這個方法的創新顯然不是測序原理，而是測序原理的實現方法。注意，實現方法。也就是說，它有極大的可能是為了繞開智財權壁壘而產生的。
意義不在於在原理上有多大幅度的創新（並沒有）或者在效能指標上有多少提高（並沒有），而在於這個實現方法很可能不侵犯任何現有的NGS相關的智財權。
綜上，中國可能會在不久的將來有一台（一系列）新的擁有自主智財權的、效能基本達到主流水平的NGS測序儀問世。這可能才是這篇文章的作者們真正想要達成的目標吧。
最後，留幾個個人的小疑問：
對於多個連續相同鹼基，這個方法的糾錯能力到底有多強？
SNA成本低、反應速度快的優勢能抵消三遍測序帶來的成本和時間開銷嗎？
這個方法能體現出SNA的長讀長優勢嗎？
2樓：核酸2蛋白
測序原理樓上已經說的很清楚，不在贅述。關於創新之處其實就是每個鹼基都測三遍，可能會在一定程度上提公升測序準確度。但我沒有看nature biotech的原文，更沒有深入研究過業內同行是否對這種方法的測試，不太好說到底是否提公升了準確率，提公升了多少。
其實solid測序平台，每個鹼基測兩次，號稱提公升了準確率，可實際效果也並不太明顯。至於說這種測序儀的測序費用，實際應用和市場推廣方面我是不太看好的，畢竟現在是illumina公司一統二代測序江湖，而且三代測序也是方興未艾！
3樓：
就知道一定會有人提問。真開心我認識原作者，手動@Alexis Voinov，文章主要作者之一。鼓掌～
我只能簡單解釋一下他們創新的原理，更詳細的還需要作者親自解釋。
二代測序都是Sequencing by synthesis（SBS），即邊合成邊測序，合成所需的鹼基底物都被加上了螢光基團，在合成的過程中，每配對成功乙個鹼基，這個新連上的鹼基就釋放出乙個螢光基團。
現在普遍使用的Illumina機器就是基於這種原理，把四種合成所需的基本鹼基ATCG，每一種都加上顏色不同的螢光基團，每一輪反應都新增四種鹼基，每完成一輪反應（即合成時產物上多新增乙個和模板互補配對上的鹼基）拍一次照，通過顏色訊號確認是哪種鹼基。
黃老師組的方法是在SBS的思路上做的優化。
首先，他們只用一種螢光基團，叫做Tokyo Green（因為我喜歡Tokyo所以我喜歡這個名字）。
其次，他們每一次反應只新增2種鹼基，一輪反應新增2次以cover4種鹼基，而且4種鹼基的螢光顏色相同。
最後，他們需要通過3次合成來確認鹼基。
那他們是怎麼做到的呢？
答案是用腦子，哈哈哈。
先來看個圖。
看起來不知道要做什麼對不對？
我一步步解釋下。
我們都知道，DNA基本的鹼基有ATCG共4種（不包括修飾等）。
如上圖，我們可以把這4個鹼基兩兩分為一組，即上圖兩兩鹼基之間的連線，可以分為6組(每組內的2個鹼基沒有先後順序)。給他們的小組都起個名字吧。
AT：W
AG：R
AC：M
CG：S
TG：K
CT：Y
再按能cover 4種鹼基把6個小組分成3個大組：
兩條橫線對應的兩個組（W和S），兩條豎線對應的兩個組（M和K），兩條對角線對應的兩個組（Y和R）。
測序合成時，每次都是順著模板鏈把整個一條DNA合成完，下一次合成時把合成產物擦掉沿著模板鏈再來一次。在每乙個鹼基位置等待互補配對時，都要加入某乙個鹼基大組（即先後加入2個小組），即WS、MK或YR。每加入乙個小組，就讀一次螢光訊號；每次合成中，同乙個位置就會讀2次訊號。
對一條序列，共進行3次合成，每個位置總共就會讀6次有或無的訊號。
那麼，理論上，這個位置如果是A，機器就會在且僅在加入的小組是W、M和R時讀到一共3次綠色的訊號，即A＝W∩M∩R。
對T、C和G，同理。
所以，由三次測序後得到綠色訊號的是哪三組，取並集就可以得到這個位置的鹼基了。
再反過來看上面的圖，你會發現，其實A＝W∩M或M∩R或W∩R，理論上測兩輪就夠了。
那為什麼還要測3輪呢？
為了防止某一輪讀錯咯。
看，是不是靠腦子做到的？
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